Kỹ thuật PCR trong chẩn đoán sớm bệnh Virus đốm trắng

Nguồn: Võ Văn Nha-TTNCTS III-2004

Qui trình kỹ thuật PCR được thực hiện qua các bước chính như sơ đồ hình 2, 3. 1. Chuẩn bị mẫu + Mẫu tôm Postlarvae: lấy mẫu nguyên con khoảng 100 - 150 con còn sống (là tốt nhất) hoặc cố định trong cồn 950 . + Mẫu tôm giống: lấy toàn bộ phần đầu của tôm (có cả các cơ quan bên trong), số lượng khoảng 100 - 150 con, tùy số lượng tôm trong đàn nhưng tổng trọng lượng không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0,1 gam, lấy mẫu tươi hay đã được cố định trong cồn 950. + Mẫu tôm nuôi: lấy một phần nhỏ mang của 10 - 20 con có biểu hiện bệnh lý đặc trưng nhưng tổng trọng lượng không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0,1 gam, lấy mẫu tươi hoặc cố định trong cồn 950. + Mẫu tôm mẹ: lấy mẫu tôm mẹ phức tạp hơn vì phải đảm bảo tôm vẫn còn sống để tham gia sinh sản. Do vậy, ưu tiên lấy mẫu mắt, chân bơi 2 hoặc một phần mang, lấy mẫu tươi hoặc cố định trong cồn 950. Lượng mẫu không quá 1 gam và cũng không nhỏ hơn 0,1 gam Hình 1: Trình tự phân tích bệnh virus đốm trắng bằng kỹ thuật PCR ở tôm nuôi Hình 2: Qui trình chẩn đoán bệnh virus đốm trắng ở tôm sú bằng kỹ thuật PCR 2. Tách chiết DNA (Desoxyribonucleic Acid) Nguyên tắc của việc tách chiết này là dựa trên sự phối hợp cơ học (nghiền), hóa học và sốc nhiệt để tách chiết DNA virus ra dịch chiết. Cụ thể, mẫu được nghiền trong bộ nghiền mẫu vô trùng với một lượng dung dịch tách chiết DNA (NaOH và SDS). Dịch nghiền được đưa vào biến tính bằng cách đun sôi 5 - 10 phút rồi làm lạnh nhanh ở điều kiện lạnh. Sau đó dịch nghiền được ly lâm 5 phút với tốc độ 13.000 vòng/phút. Dịch nổi thu được sau khi ly tâm đưa vào khuyếch đại DNA hoặc bảo quản lạnh –20oC trong vòng một tuần (khi mẫu chưa được phân tích ngay). 3. Khuyếch đại DNA Việc khuyếch đại DNA được thực hiện bằng một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: + Giai đoạn biến tính (denaturation): phân tử DNA được tách ra làm hai mạch đơn ở nhiệt độ 94oC. Thời gian này kéo dài 30 giây đến 1 phút + Giai đoạn lai (hybridization): là giai đoạn các “mồi” bắt cặp với “khuôn” ở nhiệt độ thấp hơn (khoảng 55oC). Thời gian này kéo dài 30 giây đến 1 phút + Giai đoạn kéo dài (elongation) hay tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho enzyme DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian này kéo dài 30 giây đến 1 phút Một chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuyếch đại theo cấp số nhân. Hiện nay có rất nhiều phương pháp khuyếch đại DNA khác nhau bằng một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau nhưng trong giới hạn bài viết này, chúng tôi giới thiệu phản ứng PCR theo phương pháp Nested PCR của Lo và cộng sự (1996) mà Labo Bệnh học Thủy sản, Trung tâm Nghiên cứu Thủy sản III thường áp dụng. Phản ứng gồm hai lần khuyếch đại đặc hiệu một đoạn gen của virus đốm trắng (WSSV) dựa trên các cặp mồi đặc hiệu là 146F1, 146R1 để khuyếch đại lần 1, cho sản phẩm có độ dài 1441bp và cặp mồi 146F2, 146R2 khuyếch đại lần 2, cho sản phẩm khuyếch đại có độ dài 941bp. Phản ứng khuyếch đại PCR cả 2 bước được thực hiện trên máy luân nhiệt và cài đặt với cùng một chế độ phản ứng: 94oC trong 4 phút (1 chu kỳ). 94oC trong 1 phút, 55oC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút (39 chu kỳ). 72oC trong 7 phút (1 chu kỳ). 4oC cho đến khi phân tích. 4. Điện di sản phẩm khuyếch đại Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Các đại phân tử này tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Gel agarose 1% được pha chế trong dung dịch đệm TBE 1X. Đun chảy hoàn toàn, để nguội khoảng 60oC rồi thêm 4 -5(l ethidium bromide/80-100ml agarose. Sau đó đưa vào khay điện di có chứa dung dịch TBE 1X rồi tiến hành điện di. 10(l sản phẩm khuyếch đại được trộn với 2(l geloading buffer rồi cho vào giếng thạch. Điện di trong thời gian 30 phút ở 100V và 50mA 5. Phân tích kết quả Sau khi kết thúc việc điện di sản phẩm khuyếch đại, chuyển sản phẩm điện di lên bàn đọc UV và quan sát kết quả. Tùy vào mẫu phân tích là tôm bố mẹ hay postlarvae… mà kết quả PCR bước 1 và PCR bước 2 cho những kết luận khác nhau: - Mẫu tôm bố mẹ + Nếu kết quả của phép thử PCR bước 1 là dương tính thì tôm mẹ đó khó sống được sau sinh sản và sẽ có biểu hiện đặc trưng của bệnh do virus đốm trắng. Ngược lại, nếu âm tính thì tôm mẹ này có thể tạo ra đàn postlarvae nhiễm virus gây bệnh đốm trắng ở mức thấp hay chưa nhiễm virus đốm trắng. + Nếu kết quả phép thử PCR bước 2 dương tính thì tôm bố mẹ đó có thể sinh ra đàn post nhiễm virus gây bệnh đốm trắng ở mức thấp. Ngược lại, nếu âm tính thì tôm mẹ sinh ra đàn postlarvae là tốt nhất. - Mẫu tôm postlarvae + Nếu kết quả PCR bước 1 là dương tính thì đàn postlarvae cho khả năng mắc bệnh đốm trắng cao, cần loại bỏ không nên đem nuôi thịt. Ngược lại, nếu âm tính thì có thể đàn postlarvae này có mức cảm nhiễm virus đốm trắng còn thấp hay chưa nhiễm virus gây bệnh đốm trắng, có thể nuôi thịt được nhưng cần quản lý môi trường nuôi tốt, tránh sốc các yếu tố môi trường như: nhiệt độ, pH, oxy hòa tan và khí độc … + Nếu kết quả PCR bước 2 dương tính thì đàn postlarvae này có thể sống trong 13 tháng không biểu hiện bệnh virus đốm trắng khi điều kiện môi trường tốt. Ngược lại, nếu âm tính thì đàn postlarvae này có nguy cơ nhiễm bệnh virus đốm trắng thấp nhất. 6. Ưu nhược điểm của kỹ thuật PCR - Ưu điểm: phương pháp PCR cho kết quả nhanh (trong ngày) và có độ tin cậy cao. Kết quả thu được mang tính khách quan, trung thực khi người phân tích kết quả tốt, đồng thời nó cũng có thể định lượng được số lượng virus trong mẫu đem phân tích đơn giản hơn các phương pháp khác.- Nhược điểm: phương pháp này cũng có những hạn chế đáng kể đòi hỏi sự thận trọng khi sử dụng: sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuyếch đại bản sao của phương pháp này. Các sai sót gây ra do Taqpolymerase trong qua trình tổng hợp và kích thước của trình tự cần khuyếch đại phải dưới 1,5 kb.